Comparación de la composición proteica y la toxicidad in vitro del veneno de los escorpiones cubanos Rhopalurus junceus y Centruroides gracilis.

Alexis Díaz García-1*
Luis Morier Díaz-2
Hermis Rodríguez Sánchez-2
Yamira Caballero Lorenzo-2
José A. Fraga Castro-1

1-Laboratorios de Producciones Biofarmacéuticas y Químicas, LABIOFAM.
2-Departamento de Microbiología, Laboratorio de Cultivos Celulares, Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri, La Habana, Cuba.
*Email: alexisdg@infomed.sld.cu

La familia Buthidae contiene 81 géneros y 639 especies. Es la más extensa y abarcadora de todas las familias de escorpiones. Es el único género que contiene especies letales al hombre, alrededor de 20 [1]. Las picaduras por escorpiones de esta familia son un evento común en países tropicales y subtropicales [2,3], donde existe una alta tasa de mortalidad entre las víctimas. Esto ha motivado un auge en la investigación de los síntomas clínicos y en la caracterización y determinación de la toxicidad de los venenos de escorpión [4-6].

El veneno de escorpión presenta diferencias en el contenido y composición proteico dentro de una misma especie y entre especies diferentes [7,8]. Esta variabilidad es dependiente de factores como la edad, el sexo, la alimentación y la zona geográfica, los cuales tienen influencia incluso sobre las manifestaciones clínicas y la toxicología [9,10].

En Cuba existen actualmente 32 especies y subespecies de escorpiones de la familia Buthidae, de las cuales la mayoría se consideran endémicas del país. Entre estas se encuentra Rhopalurus junceus (R. junceus) la cual es endémica de Cuba [11], mientras Centruroides gracilis (C. gracilis) se localiza en varias regiones de las Antillas y en Centroamérica. En Cuba estas dos especies tienen una amplia distribución.

Hasta el presente, en nuestro país, el veneno de ambos escorpiones ha sido escasamente estudiado, por lo que no se cuenta con suficiente conocimiento sobre su composición proteica y actividad biológica. En este trabajo se realizará un estudio comparativo de la composición del veneno de los escorpiones R. junceus y C. gracilis provenientes de diferentes provincias del país y su toxicidad en líneas celulares in vitro.

Materiales y métodos

Escorpiones: se utilizaron escorpiones adultos de la especie Rhopalurus junceus provenientes de seis provincias del país (Pinar del Río, Matanzas, Ciego de Ávila, Las Tunas, Holguín y Guantánamo) y Centruroides gracilis provenientes de cuatro provincias (Pinar del Río, Matanzas, Holguín, Guantánamo), capturados en su hábitat natural.

Veneno: el veneno de los escorpiones R. junceus y C. gracilis se extrajo por estimulación eléctrica y se diluyó en agua bidestilada convenientemente. Posteriormente se clarificó por centrifugación a 15 000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se separó y se calculó la concentración de proteínas por el método de Lowry modificado [12].

Electroforesis en geles de poliacrilamida: las muestras del veneno de R. junceus y de C. gracilis se analizaron en geles de poliacrilamida para proteínas en condiciones reductoras [13]  a un 16 % de gel separador y 4 % gel concentrador y se corrieron en una cámara de electroforesis (Biorad, Mini-PROTEAN® ll). En cada pocillo se adicionó una cantidad equivalente a 50 µg de proteínas de cada veneno. El peso molecular se estimó por marcadores intermedios corridos en paralelo con las muestras. La corrida se realizó a 120 V, 400 mA, durante 2 h. El gel fue teñido con una solución que contenía Coomasie Blue G-250 y las bandas de proteínas se visualizaron en el gel mediante una solución de destinción.

Cromatografía líquida de baja presión (CLBP): para el análisis de la variación cualitativa y cuantitativa del contenido proteico total, el veneno se disolvió en acetato de amonio 0.1 M (NH4Ac) con vórtex y se centrifugó a 15 000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se inyectó y se separó en una columna de gel filtración Superdex 75 HR 10/30, con dimensiones de 10 mm x 300 mm, implementada sobre un sistema AKTA FPLC (Amersham Pharmacia Biotech) [14]. La columna se equilibró con 0.1 M de NH4Ac y el material eluyó en el mismo solvente a una velocidad de flujo de 0.5 mL/min. La absorbancia se monitoreó a una longitud de onda de 280 nm durante 72 min.

Determinación de las masas moleculares relativas: las proteínas ribonucleasa A (13.7 kDa), quimotripsinógeno (25 kDa), ovoalbúmina (43 kDa), albúmina (67 kDa) y azul dextrana 2000 se emplearon como patrones y se corrieron en las mismas condiciones que el veneno. A partir de los tiempos de retención y las masas moleculares conocidas se construyó una curva patrón para determinar las masas moleculares relativas de las diferentes fracciones de proteínas obtenidas durante la cromatografía.

Toxicidad in vitro: el veneno de ambas especies proveniente de la provincia de Guantánamo se empleó para los estudios de toxicidad, que se determinó mediante el ensayo colorimétrico de Mosmann [15]. El ensayo se realizó en placas de 96 pozos de fondo plano para cultivo de células. Se evaluaron cuatro líneas celulares: Vero (riñón de mono verde africano), C6/36HT (larva mosquito Aedes arbopictus), MRC-5 (fibroblastos humano de pulmón) y la línea celular tumoral Hela (carcinoma de cérvix humano). En cada pozo se adicionaron 50 µL de células de cada línea celular y se incubó en atmósfera de 5 % de CO2 a 37 ºC durante toda la noche. Luego se adicionaron 50 µL de medio de cultivo con el veneno previamente disuelto para quedar a concentraciones finales de 0.25, 0.5, 0.75 y 1 mg/mL, respectivamente en cada pozo. Todas las líneas celulares quedaron a concentración final de 104 células/pozo. El suero fetal bovino (SFB) se empleó en el medio al 10 %. Las placas se incubaron en atmósfera de 5 % de CO2 a 37 ºC durante 72 h.

Al cabo de este tiempo se adicionaron 10 µL de una solución estéril de sales de tetrazolium (MTT) 5 mg/mL en PBS estéril en cada pozo. Las placas se incubaron en atmósfera de 5 % de CO2 a 37 ºC durante 3 h. El medio de cultivo se eliminó cuidadosamente y se adicionaron 100 µL/pozo de DMSO. La densidad óptica (DO) se leyó en un lector de microplacas de ELISA MRX Revelation Dynex Technologies a 560 nm con 630 nm como referencia. La evaluación para cada concentración de veneno se realizó por triplicado y se realizaron tres ensayos. Las curvas de concentración-respuesta se obtuvieron graficando la absorbancia versus las diferentes concentraciones de veneno. La citotoxicidad se expresó como la CC50, la concentración del veneno que causa el decrecimiento del 50 % en el número de células viables (absorbancia del MTT) comparada con controles no tratados y se calculó por la fórmula 1-DO (muestra)/DO (control) X 100 [16].

Análisis estadístico: se realizó el test no paramétrico Kruskas-Wallis para comparación de los datos de cada una de las concentraciones evaluadas en cada línea celular. En todos los casos se consideró la diferencia significativa para p<0.05.

Resultados

Electroforesis en geles de poliacrilamida: el veneno del escorpión R. junceus, proveniente de cada una de las seis provincias, no mostró diferencias en los perfiles electroforéticos en cuanto al número de bandas de proteínas (figura 1. Carriles 1-6).

La diferencia entre las muestras se encontró fundamentalmente en la intensidad de las bandas de proteínas en cada carril. Por encima de los 66 kDa apareció una banda con muy poca intensidad y poco definida en todos los casos.

Al nivel de los 66 kDa y 45 kDa se observó una banda poco definida en todos los casos, excepto para el veneno procedente de Guantánamo, el cual mostró una banda definida y de mayor intensidad que el resto al nivel de los 45 kDa. Se observaron dos bandas de proteínas por encima de 29 kDa y 24 kDa en todas las muestras y las diferencias más notables en intensidad fueron en los carriles 4 y 6. Una característica presente en todas las muestras de veneno del escorpión R. junceus fue una banda mayoritaria que se observó por debajo de los 14 kDa, lo cual muestra que el contenido principal del veneno en esta técnica es de proteínas de bajo peso molecular. A partir de las características observadas en el gel de proteínas, las muestras de R. junceus se pueden separar en tres grupos; el primero constituido por el carril 1 (Guantánamo), el segundo grupo por los carriles 2, 3 y 5 (Matanzas, Ciego de Ávila, Tunas) y el tercer grupo por los carriles 4 y 6 (Pinar del Río y Holguín).

En la figura 1 los carriles siete y ocho corresponden a los perfiles electroforéticos del escorpión C. gracilis. Las bandas de proteínas al nivel de los 66 kDa y 45 kDa no fueron evidentes. Al nivel de los 29 kDa y 24 kDa, respectivamente, aparecieron dos bandas muy tenues cuando se compararon con el veneno de R. junceus. En todos los perfiles electroforéticos se encontró una banda de proteínas mayoritaria por debajo de los 14 kDa al igual que en R. junceus. La principal característica del veneno de C. gracilis fue la presencia en los dos casos de una banda de 18 kDa que no apareció en ninguna de las muestras de R. junceus.

Comparación de cromatogramas de la especie R. junceus: el estudio de la composición del veneno de R. junceus mediante CLBP mostró diferencias en los patrones de elusión (figura 2A).

El veneno eluyó durante 72 min a una velocidad de flujo constante de 0.5 mL/min, monitoreado a 280 nm.

Los cromatogramas pertenecientes a R. junceus mostraron variaciones cualitativas y cuantitativa del contenido proteico. Los perfiles tuvieron un rango de elusión desde los 20 min hasta los 72 min y el peso molecular relativo de cada muestra fue de 72 kDa a 3 kDa. Los perfiles cromatográficos de cada región mostraron como promedio nueve picos, de los cuales siete tuvieron un 100 % de coincidencia en todas las muestras. Los picos de proteínas que eluyeron a los 32 min, 38 min y 58 min tuvieron significativos rangos de absorbancia a 280 nm. La mayor diferencia entre las curvas del veneno de R. junceus se observó por debajo de los 13.7 kDa; en esta zona se evidenció una elevada concentración de picos de proteína y los niveles de absorbancia fueron variables.

Comparación de cromatogramas de la especie C. gracilis: el veneno del escorpión C. gracilis, proveniente de cuatro provincias del país, se analizó igualmente por CLBP. En la figura 2B se observan los perfiles de gel filtración obtenidos para cada una de las muestras de este escorpión.
Las perfiles cromatográficos presentaron comportamientos muy similares y los picos de proteínas mostraron patrones de elusión altamente coincidentes. Los cromatogramas presentaron un rango de elusión desde los 20 min hasta los 60 min y el peso molecular relativo de cada muestra fue de 72 kDa a 4 kDa. Las curvas mostraron en todos los casos siete picos de proteína. Los mayores rangos de absorbancia se observaron a los 36 min de elusión en todos los casos.

Los perfiles de gel filtración encontrados en las cuatro muestras evidencian que la composición del veneno del escorpión C. gracilis presenta una mayor similitud para las provincias analizadas cuando se comparó con R. junceus. La gran similitud entre las diferentes curvas de este escorpión podría evidenciar un comportamiento distinguible con respecto a la especie R. junceus.

Comparación de cromatogramas entre R. junceus y C. gracilis: los picos característicos en cada uno de los cromatogramas se analizaron para las dos especies. Los perfiles mostraron seis picos de proteínas comunes para ambos escorpiones, aunque los valores promedios de absorbancia fueron variables de una especie a otra (tabla 1).

 

Tr (min) R.Junceus (A) C.gracilis (A)
PMR (kDa)
20 1 1.4 67
28 5 - 45
32 17.7 8.8 40
34 7.5 14.2 29
36 - 35.5 16
38 22.75 12.5 14
40 6.6 - 8
44 7 - 6
48 9 6 4
58 17.7 11.3 <3
65 7 -  
Tabla 1. Distribución de los picos de proteínas representativos para cada especie. Tr: tiempo de retención (min); A: absorbancia promedio de los picos. PMR: pesos moleculares relativos determinados a partir de una curva patrón.

 

Los perfiles cromatográficos mostraron picos de proteínas distintivos para cada especie, tal es el caso de los que eluyen a los 36 min en la especie C. gracilis, así como a los 28 min, 40 min, 44 min y 65 min en la R. junceus.

Toxicidad in vitro: la evaluación de la toxicidad del veneno de ambos escorpiones se realizó en cuatro líneas celulares C6/36HT, Vero, MRC-5 y Hela. La exposición durante 72 h del veneno de ambos escorpiones provocó una inhibición significativa del crecimiento en C6/36HT (p<0.05) con respecto al resto de las líneas celulares (figura 3A y 3B).

La CC50 fue de 0.6 y 0.8 mg/mL para C. gracilis y R. junceus, respectivamente. El efecto del veneno fue dependiente de la concentración empleada y se evidenció desde las diluciones más bajas empleadas, en las que se observó ruptura del cultivo celular, marcada picnosis y restos celulares característicos de la alta toxicidad de ambos venenos sobre esta línea celular.

La línea celular MRC-5 tuvo igualmente una inhibición significativa del crecimiento (p<0.05) para el veneno de C. gracilis a las mayores concentraciones empleadas. Las líneas celulares Vero y MRC-5 no mostraron sensibilidad con respecto al veneno de R. junceus.

La diferencia en la toxicidad encontrada en los venenos se evidenció en la línea celular tumoral Hela. El veneno del escorpión R. junceus mostró una inhibición significativa del crecimiento desde 0.5 mg/mL para esta línea celular. La CC50 fue de 1.5 mg/mL mientras que para C. gracilis no se observó sensibilidad en el rango de concentraciones evaluadas.

Discusión

En la comparación de la composición proteica del veneno, en la electroforesis de proteínas, las principales variaciones se evidenciaron en la intensidad de las bandas cuando se compararon muestras de la misma especie o ambas especies.

La mayoría de las bandas de proteínas en ambas especies fueron coincidentes, con excepción de la banda de 18 kDa, la cual estuvo presente solo en C. gracilis. Las proteínas mayoritarias aparecen en todos los casos al nivel de los 14 kDa como una gran mancha en esta técnica. Resultados similares a los nuestros fueron expuestos por Nishikawa y col. [17], quienes emplearon las separaciones en geles de proteínas y la inmunoelectroforesis con suero hiperinmune contra el veneno de varias especies de escorpiones y demostraron la existencia de bandas de proteínas comunes para varios géneros de la familia Buthidae. Igualmente existió una concentración de bandas de proteínas hacia los 14 kDa. La técnica de SDS-PAGE realizada con geles homogéneos, como en nuestro caso, provoca la superposición de bandas de proteínas debido a la porosidad uniforme del gel. Esta característica provocó posiblemente que se encontraran pocas diferencias entre ambas especies. Variaciones de esta técnica podrían permitir un estudio más detallado de los componentes proteicos del veneno de escorpión [18,19].

Las limitaciones de la electroforesis de proteínas potencian la cromatografía de exclusión molecular como una mejor opción para mostrar la variabilidad en el veneno de escorpiones de una misma especie y de especies diferentes.

Al comparar los resultados obtenidos entre ambas especies se pueden apreciar diferencias cualitativas y cuantitativas. Los perfiles generales de los venenos de las especies de R. junceus y C. gracilis mostraron la posibilidad de la comparación cromatográfica y la diferenciación de una u otra especie, fundamentalmente por la elevada homogeneidad de las muestras de C. gracilis. La cromatografía en gel filtración proporciona patrones propios para diferentes especies y permite corroborar la composición del veneno en animales de la misma especie [20,21].

El veneno de ambas especies evidenció mayor toxicidad sobre la línea celular de mosquito C6/36HT. Los insectos constituyen parte de las presas en el hábitat de los escorpiones [22]. El veneno de estos animales contiene un amplio número de toxinas que afectan selectivamente la actividad fisiológica de canales iónicos presentes en las células de insectos, lo que provoca la muerte [23]. La toxicidad diferencial de ambos venenos sobre Hela podría estar relacionada con la diferencia en la composición proteica. Kalapothakis y Chavez-Olortegui [24] en un estudio con el veneno del escorpión Tityus serrulatus, concluyeron que los signos de toxicidad reflejan las variaciones en la composición de los venenos de escorpión.

Conclusiones

Los análisis comparativos de los perfiles cromatográficos mostraron las diferencias en la composición del veneno de ambas especies. Los estudios en líneas celulares determinaron la toxicidad diferencial de ambos venenos sobre células de insectos y evidenció la selectividad del veneno de R. junceus sobre la línea celular tumoral, lo que puede estar relacionado con la composición proteica y podría ser una característica distintiva de esta especie.

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Figura 1. SDS-PAGE de las muestras de veneno de escorpiones de diferentes regiones del país. Gel concentrador 4 % y gel separador al 16 %. Carril 1-6: muestras de veneno del escorpión R. junceus. 1: Guantánamo; 2: Matanzas; 3: Ciego de Ávila; 4: Pinar del Río; 5: Tunas; 6: Holguín; 7: C. gracilis (Matanzas); 8: C. gracilis (Guantánamo).
Figura 1. SDS-PAGE de las muestras de veneno de escorpiones de diferentes regiones del país. Gel concentrador 4 % y gel separador al 16 %. Carril 1-6: muestras de veneno del escorpión R. junceus. 1: Guantánamo; 2: Matanzas; 3: Ciego de Ávila; 4: Pinar del Río; 5: Tunas; 6: Holguín; 7: C. gracilis (Matanzas); 8: C. gracilis (Guantánamo).
Figura 2. Perfiles cromatográficos solapados de las muestras de veneno: A) R. junceus B) C. gracilis
Figura 2. Perfiles cromatográficos solapados de las muestras de veneno: A) R. junceus B) C. gracilis
Figura 3. Curvas de efecto-concentración del veneno de los escorpiones A) R. junceus; B) C. gracilis sobre las líneas celulares empleadas en el estudio.
Figura 3. Curvas de efecto-concentración del veneno de los escorpiones A) R. junceus; B) C. gracilis sobre las líneas celulares empleadas en el estudio.